強直性脊柱炎（AS）是一種全身性炎癥性疾病，據(jù)報道中國人群的患病率為0.29%。強直性脊柱炎可能造成不可逆的骨骼結(jié)構(gòu)損傷和殘疾，導(dǎo)致疲勞、睡眠障礙、精神疾病等，最終致使患者生活質(zhì)量下降，并給醫(yī)療保健系統(tǒng)和社會帶來巨大的經(jīng)濟壓力。強直性脊柱炎疾病活動度指數(shù)（BASDAI）是衡量強直性脊柱炎疾病活動的常用指標(biāo)，但由于其主觀性和患者驅(qū)動的性質(zhì)，存在一定局限性?，F(xiàn)階段關(guān)于強直性脊柱炎潛在生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍然有限，該領(lǐng)域的進一步探索對于了解強直性脊柱炎的發(fā)病機制以及確定新的診斷和治療策略至關(guān)重要。
2025年5月，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院劉宏瀟團隊與國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心馬潔團隊在Journal of Advanced Research（IF=11.4）期刊上發(fā)表題為“Characterization of immune features and discovery of potential biomarkers for ankylosing spondylitis using deep plasma proteomics”的最新研究成果，利用深度血漿蛋白質(zhì)組學(xué)描述免疫特征并發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物。
北京青蓮百奧生物科技有限公司為該研究提供基于MagicOmics DMB低豐度蛋白富集磁珠試劑盒的深度血漿蛋白質(zhì)組學(xué)檢測服務(wù)。
研究首先對發(fā)現(xiàn)隊列（n=104，包括活動期強直性脊柱炎患者，n=48；穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者，n =21；健康對照者，n=35）進行血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析，根據(jù)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)研究強直性脊柱炎的免疫特征和功能障礙；之后通過結(jié)合隨機森林算法（RF）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），構(gòu)建機器學(xué)習(xí)模型驅(qū)動的評分矩陣，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作為強直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物；最后，在驗證隊列（n=79，包括活動期強直性脊柱炎患者，n=27；穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者，n=28；健康對照者，n=24）中通過ELISA實現(xiàn)驗證。
圖1 強直性脊柱炎深度血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析工作流程
值得一提的是，本研究的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析使用青蓮百奧自研MagicOmics DMB低豐度蛋白富集磁珠試劑盒實現(xiàn)前處理，采用數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）模式進行質(zhì)譜檢測，最終共鑒定到3891種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)豐度分布達7個數(shù)量級，體現(xiàn)了血漿蛋白質(zhì)組的深度覆蓋。
強直性脊柱炎是一種與免疫性疾病密切相關(guān)的疾病，多種免疫細胞和炎癥介質(zhì)對其發(fā)病機制有顯著影響；本研究根據(jù)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)通過CIBERSORT方法計算免疫細胞類型和比例，進而描述強直性脊柱炎患者的免疫學(xué)特征。
結(jié)果表明，記憶B淋巴細胞、M2型巨噬細胞、靜息記憶CD4+ T細胞和初始CD4+ T細胞的比例在三組之間存在顯著差異。與健康對照者相比，在活動期強直性脊柱炎患者中觀察到靜息記憶CD4+ T細胞數(shù)量顯著增加；在穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者中觀察到M2型巨噬細胞數(shù)量增加，表明其在強直性脊柱炎穩(wěn)定中的潛在作用。
圖2 基于血漿蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的強直性脊柱炎免疫特征
與健康對照者相比，在活動期強直性脊柱炎患者中確定了376個差異表達蛋白質(zhì)（DEP）。分析表明，203個上調(diào)蛋白質(zhì)主要參與凝血、肌動蛋白絲組織、傷口愈合以及白細胞遷移等功能，173個下調(diào)蛋白質(zhì)主要參與代謝過程、RNA加工、運輸和定位以及翻譯等功能。
圖3 活動期強直性脊柱炎患者和健康對照者的蛋白質(zhì)組學(xué)特征和功能分析
對這376個差異表達蛋白質(zhì)進行k-means聚類表達趨勢分析，在健康對照者、活動期強直性脊柱炎患者、穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者三組中揭示了四簇不同的聚類。其中：
簇1包含在活動期強直性脊柱炎患者中相比健康對照表達下調(diào)，但在穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者中恢復(fù)的蛋白質(zhì)，主要富集于胰高血糖素信號通路、丙酮酸代謝和糖異生，這部分蛋白質(zhì)的相關(guān)功能在活動期強直性脊柱炎患者中可能喪失；
簇4包含在活動期強直性脊柱炎患者中相比健康對照表達上調(diào)，但在穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者中恢復(fù)的蛋白質(zhì)，主要富集于肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、黏著斑和趨化因子信號通路，這部分功能蛋白質(zhì)的失調(diào)可能與強直性脊柱炎的病理進程相關(guān)；
簇2/簇3代表在活動期強直性脊柱炎患者中表達下調(diào)/上調(diào)，但在穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者中未能恢復(fù)到健康對照水平的蛋白質(zhì)，主要富集于剪接體和核糖體通路/血小板活化、緊密連接等方面。
圖4 強直性脊柱炎不同階段的蛋白質(zhì)組學(xué)特征
基于376個差異表達蛋白質(zhì)構(gòu)建了隨機森林算法（RF）機器學(xué)習(xí)模型，用于區(qū)分強直性脊柱炎患者與健康對照者。模型以隊列70%的樣本為訓(xùn)練集，30%的樣本為獨立測試集，執(zhí)行五折交叉驗證?；煜仃囷@示，模型具有高精準(zhǔn)度和理想召回率，強直性脊柱炎患者100%被準(zhǔn)確預(yù)測為陽性病例，健康對照者91%被準(zhǔn)確預(yù)測為陰性病例。模型的受試者工作特征（ROC）與精確率-召回率（PR）曲線下面積（AUC）分別達0.926與0.918，表明其能精準(zhǔn)區(qū)分陽性與陰性病例，并以出色的準(zhǔn)確性預(yù)測陽性結(jié)果。
圖5 構(gòu)建基于隨機森林算法的模型區(qū)分強直性脊柱炎患者與健康對照者
首先，對基于隨機森林算法的模型的分類準(zhǔn)確率與基尼重要性進行排名，并將其映射到[0,5]的分值區(qū)間；之后，使用正交偏最小二乘判別分析，計算每個差異表達蛋白質(zhì)在區(qū)分活動期強直性脊柱炎患者與健康對照者時的變量投影重要性（VIP）得分，并將VIP值排序并映射到[0,5]的分值區(qū)間，根據(jù)不同的閾值標(biāo)準(zhǔn)對其相應(yīng)的校正后p-value進行劃分并予以0-5的賦分；此外，將log2|FC|（以2為底的差異倍數(shù)絕對值的對數(shù)）排序并映射到0-5的分值區(qū)間，同樣根據(jù)不同的閾值標(biāo)準(zhǔn)對其相應(yīng)的校正后p-value進行劃分并予以0-5的賦分；最終，整合上述所有評分參數(shù)構(gòu)建生物標(biāo)志物的評分矩陣，該矩陣中的平均得分指示每個蛋白質(zhì)在區(qū)分強直性脊柱炎患者與健康對照者時的重要性。
圖6 使用基于機器學(xué)習(xí)的評分矩陣識別強直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物
結(jié)合評分矩陣、功能分析和強直性脊柱炎不同階段蛋白質(zhì)表達趨勢，確定蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1作為強直性脊柱炎候選生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在活動期強直性脊柱炎患者中的表達水平均升高，在穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者中恢復(fù)正常水平，表明其可用作強直性脊柱炎的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。SAA1、FERMT3、ILK、TLN1預(yù)測強直性脊柱炎患者區(qū)分于健康對照者的判別效率分別為0.745、0.880、0.815、0.851；預(yù)測強直性脊柱炎從活動期到穩(wěn)定期的判別效率為0.719、0.813、0.850、0.851，普遍高于ESR（紅細胞沉降率，客觀炎癥標(biāo)志物）的判別效率，與CRP（C-反應(yīng)蛋白，客觀炎癥標(biāo)志物）相當(dāng)或與之相比略高。
對驗證隊列（n=79，包括活動期強直性脊柱炎患者，n=27；穩(wěn)定期強直性脊柱炎患者，n=28；健康對照者，n=24）的血漿樣本進行ELISA驗證。觀察到蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在三組間的表達趨勢與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致。利用這四種蛋白質(zhì)構(gòu)建組合模型，進一步使用ELISA數(shù)據(jù)對其進行驗證，結(jié)果表明，該模型能有效區(qū)分活動期強直性脊柱炎患者與健康對照者。這體現(xiàn)了通過基于血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的評分矩陣篩選出的強直性脊柱炎生物標(biāo)志物具備作為潛在藥物靶點以及疾病判別候選標(biāo)志物的潛力。
本研究提出了一種新策略，通過將蛋白質(zhì)組學(xué)分析與基于機器學(xué)習(xí)的方法相結(jié)合，闡明強直性脊柱炎的病理機制并發(fā)現(xiàn)了生物標(biāo)志物，并探索潛在治療靶點。通過對不同階段的強直性脊柱炎患者進行深度血漿蛋白質(zhì)組分析，觀察到幾種蛋白表達水平的動態(tài)變化，這些蛋白質(zhì)體現(xiàn)強直性脊柱炎的進展，并與其病理機制相關(guān)。最終，通過ELISA驗證蛋白質(zhì)SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作為強直性脊柱炎的潛在生物標(biāo)志物。其中，F(xiàn)ERMT3、ILK、TLN1參與整合素通路，該通路對細胞粘附和遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與細胞外基質(zhì)的相互作用至關(guān)重要，表明其可能與在強直性脊柱炎中觀察到的炎癥反應(yīng)有關(guān)。整合素通路中的相關(guān)分子可能作為強直性脊柱炎的潛在治療靶點，需要進一步研究。
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